自噬流檢測(cè)
自噬是調(diào)節(jié)真核細(xì)鵬生長(zhǎng)、和能量代謝的重要生物學(xué)機(jī)制。細(xì)胞自噬行使其生物學(xué)功能的前提是自噬流的話化。大量證據(jù)表明自噬流受損與多種慢性炎性---，---是、神經(jīng)退行性---及組織纖維化的發(fā)病密切相關(guān)，目前對(duì)于自噬液的檢別是自噬與其相關(guān)---研究領(lǐng)域的---。由于自噬流是一個(gè)曲多個(gè)步驟組成的動(dòng)態(tài)過(guò)程。因此往需要精細(xì)的突驗(yàn)才能準(zhǔn)確判斷自啦流狀態(tài)。
細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的污染及解決方法
---污染
---污染后，培養(yǎng)基一般清澈，保持原色。細(xì)絲可以在顯微鏡下觀察到。，一些---類(lèi)似于---碎片，但其中許多清晰可見(jiàn)，看起來(lái)像珊瑚，293t細(xì)胞，比較容易區(qū)分。此外，它們會(huì)慢慢長(zhǎng)出細(xì)細(xì)的黑色細(xì)絲，因?yàn)樗鼈兩L(zhǎng)得比較慢，不像---那樣容易被發(fā)現(xiàn)，一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基被污染，它們將很難存活。
解決方法：一旦被---污染，果斷丟棄，然后對(duì)細(xì)胞房、co2 培養(yǎng)箱、器皿和培養(yǎng)基進(jìn)行消毒。
細(xì)胞elispot檢測(cè)
1．培養(yǎng)板的預(yù)處理：在24孔培養(yǎng)板內(nèi)加0.5ml 0.2%戊er醛，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室，37℃，4h，棄掉板中的處理液，用pbs洗滌3次，每次3min；
2．抗原包被：將適量抗原溶于包被緩沖液中，每孔加入0.5ml，4℃過(guò)夜，pbs-t洗滌3次，每次3min；
3．制備細(xì)胞懸液：將待測(cè)已致敏小鼠處死，取出pi臟，置于加有hanks液的平皿內(nèi)，用鈍頭直角9號(hào)zhu射器針頭破少許脾被膜后，趕出細(xì)胞，用毛細(xì)吸管輕輕吹散細(xì)胞團(tuán)后，將懸液通過(guò)250目尼龍網(wǎng)，西安細(xì)胞，取濾液，1000r/min離心5min，hanks液洗滌3次，計(jì)數(shù)細(xì)胞后，用1640液重新懸浮細(xì)胞，配成所需濃度；
4．往各孔中加入0.5ml含不同濃度104-106/ml的細(xì)胞懸液，置37℃，5％co2條件下孵育2-4h，棄掉培養(yǎng)液，pbs-t洗滌3次，每次3min；
5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗tibio-ab2μg/ml，37℃孵育1h或4℃過(guò)夜，棄掉液體，pbs-t洗滌3次，每次3min；
6．加入辣根---化物酶結(jié)合的親合素avi-hrp2μg/ml，37℃孵育30min，棄掉液體，pbs-t洗滌3次，單細(xì)胞測(cè)序，每次3min；
7．配制明膠-底物液：在37℃水浴中，將2.5mltmb溶液4mg/ml jia醇溶液滴加入7.5ml10%明膠溶液用ph5.0磷酸鈉-檸檬酸緩沖液配制邊加邊攪，溶液呈白色，加入14μl 3% h202；
8．顯色與計(jì)數(shù)：將培養(yǎng)板底冰浴，每孔加入0.6ml明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養(yǎng)板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計(jì)數(shù)所顯示出的顏色的斑點(diǎn)。
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